星湾生物创新IVD--"抗-CD19-嵌合抗原受体T细胞检测试剂盒(流式细胞仪法-PE)"

背景

自2017年首个CAR-T细胞治疗产品问世以来，该技术发展迅速，并在复发或难治性B细胞恶性肿瘤的临床治疗中表现出显著的治疗效果，是目前应用最广泛的细胞免疫疗法。其使用改造后的T细胞靶向B细胞恶性肿瘤表面的抗原，通过引入嵌合抗原受体（CAR）对T细胞进行基因工程改造，以生成靶向肿瘤的T细胞，其细胞膜上的CARs结合了抗原具有识别特异性和T细胞活化的功能。
多临床数据显示CAR-T针对B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）的应答率均高于80%，在其他血液恶性肿瘤如多发性骨髓瘤(MM)和B细胞淋巴瘤中也取得了显著的抗肿瘤效果。

细胞因子风暴是最为常见的CAR-T细胞疗法的毒性，在靶向CD19、CD22以及靶向成熟B细胞抗原的治疗中都出现此类毒性报告。在靶向CD19的CAR-T治疗中，细胞因子风暴的发生率数值宽泛从35%到93%不等。
发生转移后，CAR-T细胞就会被肿瘤细胞或者正常细胞的同类抗原激活，从而激活CAR-T细胞或者使得CAR-T细胞迅速繁殖，裂解靶向细胞，进而被注射的T细胞或者免疫细胞会释放大量炎症细胞因子。细胞因子风暴的发生与前述的过程密切相关，细胞因子风暴的发生概率和严重程度与在人体内的CAR-T细胞被激活和扩增有着极大的相关性：例如很高的肿瘤负荷、高剂量的CAR-T细胞注射、以及氟达拉滨致环磷酰胺的使用，这些可能会导致的淋巴系统衰竭。
临床前的数据表明，在非异体细胞构建的模型中，细胞因子风暴的发生机制中有单核细胞和巨噬细胞的参与。在一个模型中，由CAR-T细胞疗法引起的细胞因子风暴在转移前通过巨噬细胞耗竭而得到缓解。在另一个模型中，肿瘤相关的巨噬细胞吸收并激活靶向CD19的CAR-T细胞，是细胞因子风暴的发生的调控者，也是细胞因子风暴的标志物IL-6的主要提供来源者。

许琛琦研究组的该项科学进展通过定量质谱和生化方法，发现TCR的CD3ζ链具有特殊的信号转导功能，可以同时招募抑制性分子Csk和活化性分子PI3K。将CD3ζ胞内区加入临床使用的CAR序列中，可使得CAR-T细胞持续性更好，抗肿瘤功能更强，并且降低细胞因子释放综合症的风险。

该项科学进展中CAR-T细胞的检测主要采用星湾生物自主研发的检测产品——Rabbit anti-mouse FMC63 scFv monoclonal antibody，可以对膜上CAR分子动态实时监测。该产品是针对anti-CD19上的FMC63 scFv的兔单克隆抗体，适用于免疫荧光、流式细胞术等检测方法。在实验中我们的产品不仅能清晰染出anti-CD19 CAR-T细胞表面CAR分子，而且在抗原诱导后2小时内也能准确监测T细胞表面CAR水平的动态变化。

流式细胞术

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流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪主要由以下四部分组成：
1）液流系统：流动室、液流驱动系统
由于流式细胞仪的激发管理是固定的，一般与细胞悬液的轴心正交，这就要求细胞在必须在流经激光聚焦区时不能偏离其轴心，且不能聚集成团，阻塞管路，否则光束无法准确照射细胞中心，造成信号不稳定。
A、鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。
B、流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。

2）光学系统：激发光源、光束收集系统
流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管（PMT）接收。荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号，经光电倍增管接收后可转换为电信号。
A、激发光源:激光器
●气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子(647nm)、氪氩(568nm)；
●染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激光器，发出550-650nm可变波长激发光；
●半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。
激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、633nm。
B、光信号收集系统：
是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，他们分别将不同波长的光信号送入到不同的光信号检测器。光信收集系统的主要光学元件是滤光片，包括：
●长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；
●短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；
●带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。
3）电子系统：光电转换器、数据处理系统
电子系统组成包括：
●光电检测器：将光信号转换成电子信号。常用两类光电检测器为光电二极管及光电倍增管，光电二极管(photodiode)，光灵敏度低，测定强信号（FSC）；光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)
一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：散射光通道（FSC通道和SSC通道）、荧光通道。
a)散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forwardscatter,FSC);FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力；侧向散射光(sidescatter,SSC).SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
b) 荧光信号：自发荧光：细胞在激光照射下发出微弱的荧光；特异荧光：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。

各荧光染料的相对强度一般指导原则是，从亮到暗依次为：PE、PE-Cy 7、PE-Cy5、APC、APC-Cy7、Alexa Fluor 647®、Alexa Fluor 700®、FITC、Pacific Blue 和 Alexa Fluor 488®。这是一般排序，个别抗体的相对强度可能有所差异。
高度表达的抗原通常可被检测且与阴性对照区分开来，无论使用何种荧光染料。表达较少的抗原需要较亮的 PE 或 APC 偶联剂提供的高信号背景比，以将阳性细胞完全从未染色的细胞中区分开来。
●前置放大电路：将信号等比例放大，输出电脉冲信号。一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。
●模数转换器：将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。
●数据处理系统：计算机系统数据采集、分析。
A、常用分析软件
●CellQuest
●Diva
●FlowJO
●WinMDI
●FCSExpress
B、流式细胞术的的数据显示方式包括
a) 单参数直方图(Histogram)
b) 双参数数据显示：
●散点图(DotPlot)
●伪彩图(Pseudo-colorPlot)
●等高线图(ContourPlot)
●密度图(DensityPlot)
●假三维图(Pseudo3DPlot)
c)三维图(3DPlot)

4）细胞分选系统：喷嘴、电偏转板、样本收集器
高速流式细胞分选仪均采用电荷式细胞分选的原理，在分选过程中，给予液流高频震荡（15-100kHz），使液流断裂为打消均匀的液滴，液滴在喷嘴下面与液流分离，瞬间加电，带正电荷或负电荷的液滴经过电场作用后会发生偏转，从而可以将感兴趣的细胞分选出来。

公司简介

星湾生物注册于2020年03月19日，由苏州星湾生物科技有限公司和是专注于CAR-T治疗精准检测技术、产品和服务的全球化品牌。“助力更好的细胞治疗”是星湾生物的核心价值。作为国内领先的聚焦细胞药物精准检测领域的企业，星湾生物在独有的CAR-drive抗体筛选平台上，开发具有自主知识产权的特色检测产品，为客户提供高灵敏度、高准确性的专属检测产品，应用于细胞药物研发、生产质控和临床检测。公司团队成员为答亮、曾汉军、王宏飞、郤仕煌。